1.如何选择培养基？
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在mem中培养的细胞，很可能在dmem或m199中同样很容易生长。总之，首，选mem做粘附细胞培养、rpmi-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首，选是aim v培养基（sfm）。
2.为什么要热灭活血清？
加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养es细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
3.l-谷，氨，酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？
l-谷，氨，酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，l-谷，氨，酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。l-，谷氨，酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。l-谷，氨，酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。
4.glutamax-i是什么？培养细胞如何利用glutamax-i？这个二肽有多稳定？
glutamax-i二肽是l-谷，氨酰胺的衍生物，将其不稳定的α-氨基用l-丙氨，酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放l-谷氨，酰胺供利用。glutamax-i二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，glutamax-i二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，l-谷，氨酰胺几乎完，全降解。
5.为什么培养基中可以省去加酚红？
酚红在培养基中被用来作为ph值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。
6.如何用台盼兰计数活细胞？
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升的0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
7.如何消除组织培养的污染？
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查hepa过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两，性霉，素b和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1)在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性，霉，素b推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2-3代。
5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6)重复步骤4。
7)在无抗生素的培养基中培养4-6代，确定污染是否以已被消除。
8.培养基中丙酮酸钠的作用是什么？
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。
9.hank’s平衡，盐溶液（hbs）要在空气中使用，不需要co2培养箱。原因是什么？
hank’s平衡盐，溶液（hbs）和earle’s平衡，盐溶液（ebs）有什么本质的功能差别？hbs和ebs的主要差别在于碳酸氢，钠的水平，碳酸，氢钠的含量在eagles(2.2g/l)中比在hanks(0.35g/l)中高。碳酸氢，钠需用高水平的co2平衡，以维持溶液的ph值。eagles液在空气水平的co2中，溶液会变碱，hanks液在co2培养箱中会变酸。如果希望在co2培养箱中保存组织，需要用eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用hanks液就可以了。
10.qualified和certified胎牛血清有什么差别?
certified胎牛血清包括了qualified胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：
end-point determination of endotoxin content
噬菌体检验
生物化学检测
激素的检测
血红蛋白检测
sf9细胞生长促进及方法学检测
11.二价离子抑制胰蛋，白酶活性吗？使用胰，蛋白酶时加入edta的目的是什么？
二价离子的确抑制胰，蛋白酶活性。edta用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰，蛋白酶的活性。建议胰，蛋白酶处理细胞前，用edta清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。
12.制备lipid-dna的方法会影响转染效率吗？
是的。对于lipofectamlne reagent，稀释试剂在100µl opti-mem中，稀释dna在100µl opti-mem中。混合两种溶液在室温下孵育15分钟。对于lipofectin reagent，在加入dna溶液前允许稀释的试剂和培养基孵育至少30分钟可以增加3倍的效率。确保复合物在没有血清的情况下形成。孵育15分钟后，在复合物中加入含有血清的培养基（800µl）。（注意以上是35mm培养皿使用体积）。对于lipofectamlne plus reagent dna应该在与脂质体混合之前首先与plus reagent混合。lipofectamlne 2000的操作步骤允许在一个很小的体积下混合dna和脂质体，接下来可以不需要换培养基的情况下直接加入。
13.我使用sf900ⅱ时，细胞生长良好，但是为什么我的蛋白产物不如使用graces液和10%胎牛血清时效果好？
如果目的蛋白是一个后期蛋白，它将与蛋白酶一起表达，这些蛋白酶将会作用于目的蛋白。在加有血清的培养基中，这些蛋白酶将作用到血清中的蛋白，从而使目的蛋白产品保持完好。在无血清配方中，蛋白酶作用的唯，一底物是你的目的蛋白。为了避免这一问题，加入一些蛋白酶抑制剂或加入少量的血清（少于1％），让血清给蛋白酶提供作用底物。
14.如何检测内毒素(热源)水平？
lal（limulus amebocyte lysate）试验是可用的最敏感和特异的检测细菌内毒素的方法。levin和bang发现细菌可引起鲎（limulus polyphemus）血管内的凝集作用。内毒素启动一个细胞内酶原系统（丝，氨酸蛋白酶级联反应系统），通过修饰凝集素，产生一种透明的胶，lal中的凝固蛋白，从而，形成不可溶的基质。lal试剂缓冲的鲎（血细胞）裂解物。
胎牛血清的内毒素检测是在grand island，按照手册上gel-clot方法进行的。在对血清产品进行内毒素检测前，用无热源的水1：10稀释样品。稀释样品沸水育5分钟，以消除抑制剂。（通常，血液中的内毒素结合成份的出现会抑制凝胶过程，使内毒素不能与lal反应。样品预先热处理可以消除这种抑制作用。）
15.我可以使用固体形式的murashige skog培养基吗？
如果使用固体形式的培养基，需要加入琼脂。琼脂加入前要先灭菌。应该避免ms培养基的直接灭菌，应该高压灭菌琼脂溶液，然后把融化的琼脂溶液加入到ms培养基中。
16.20℃下配制的缓冲液，在较高或较低的温度下ph值会改变吗？
对于普通使用的缓冲液，ph值随温度变化而变化。下表列出温度改变10℃时，ph值的变化情况
例如20℃下配制ph7.4 tris缓冲液,40℃时ph值为7.4-（2x0.310）＝6.78
17.室温下(25℃)配制的tris-hcl溶液，在37℃使用时ph值是多少？
缓冲液的ph值随温度变化而变化。下表列出了50mm tris-hc溶液在4℃，25℃，37℃时，不同的ph值。
4°c 25°c 37°c
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5
18.昆虫细胞培养的最，适ph值和渗透压是多少？
生长培养基的ph值对细胞的增值和病毒或重组蛋白的生产均会产生影响。对于大部分鳞翅类昆虫细胞系，在ph值6.0-6.4范围的大部分应用效果良好。培养鳞翅类昆虫细胞系时，培养基的最，适渗透压是345-380mosm/kg.。为保证可靠和持久的细胞培养方式，减少技术问题，保持ph值和渗透压在以上所列的范围之内。
19.high five细胞有任何其它名称吗？
high five细胞也被称为trichoplasia ni 5b1-4和bti-tn-5b1-4。
20.在high five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？
high five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/l tween-80，1.0 g/l pluronic poly-all。
21.high five细胞用多大的密度冻存？
3.0x10e6 cells/ml
22.在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？
可能是谷氨，酰胺沉淀，但是更可能是l-酪氨，酸沉淀。培养基中谷氨，酰胺的浓度比典型的2mm高6倍。酪，氨酸的浓度比在rpmi 1640中高25倍，而且比谷，氨酰胺更
加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。
23.如何从t25瓶中转移sf9细胞？能用胰，蛋白酶消化吗？
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最，高。通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。
只有在绝，对必要的情况下，才使用胰，酶消化细胞。
胰，酶消化一个t25瓶的sf9细胞：
1)去除培养基。
2)用2ml 1xpbs（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除pbs.
3)加入2ml 1x胰，酶edta（恰好覆盖细胞表面）。
4)37℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。
5)向细胞中加入2ml细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的fbs终止了胰，酶的活性。）
6)离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。
7)用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
24.在sf9,sf21,和high five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
25.如何评估es细胞合格的胎牛血清？
使用d3 es细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。相关生长效率分析：当es细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持es细胞克隆的能力。
细胞毒分析：
当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测es细胞和feeder细胞的生长能力。
相关形态学和分化分析：
检测胎牛血清支持未分化es细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的es细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。
所有的分析在没有esgro的情况下进行的，培养基中出现esgro会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（esgro或lif经常用来保持es细胞处于未分化状态。）
经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养es细胞。
26.在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。